Diagnóstico molecular de Porphyromonas gingivalis: optimización del método / Molecular diagnosis of Porphyromonas gingivalis: optimization of the method

El objetivo del presente trabajo fue estandarizar y optimizar la técnica de PCR convencional para detección de Porphyromonas gingivalis ATCC 33277. Materiales y métodos: la cepa de P. gingivalis ATCC332227 se sembró en agar Bruella enriquecido con sangre de cordero, suplementado con hemina y vitamina K. El ADN se extrajo empleando el protocolo que usa bromuro de cetil trimetilamonio (CTAB). Se evaluó la cantidad y calidad del material genético obtenido con el fotómetro UV Ampli-Quat, AQ-07 Nucleic Acid. Se realizó la PCR convencional con diferentes concentraciones de MgCl2 1 mM, 1,5 mM y 2.0 mM y a dos temperaturas de alineamiento: 60ºC y 55ºC. Los productos PCR se separaron por electroforesis en un gel de agarosa 1 por ciento. Las bandas se visualizaron en un fotodocumentador. La sensibilidad se calculó teniendo en cuenta el número de bacterias en diferentes diluciones. Resultados: se obtuvo una concentración 1,55x10(6) ng/ul de ADN genómico a partir de una suspensión bacteriana de 10a células bacterianas/ml, con índice de pureza 1,648 (relación de OD260/OD280). Los mejores resultados se obtuvieron con una concentración de 2 mM de MgCl2 y una temperatura de alineación de 55ºC. En cuanto a la sensibilidad, se obtuvo un límite de detección de 5 x 10/5 uL células bacterianas en suspensión. Conclusión: en la prueba de PCR convencional para Prophyromonas gingivalis ATCC 33277, las condiciones óptimas de estandarización son la concentración de 2 mM de MgCl y 55ºC y es necesaria una carga bacteriana mínima de 5 x 10 células/5 ul como límite de detección.

In vitro effects of Melaleuca alternifolia essential oil on growth and production of volatile sulphur compounds by oral bacteria

ABSTRACT Objective Halitosis can be caused by microorganisms that produce volatile sulphur compounds (VSCs), which colonize the surface of the tongue and subgingival sites. Studies have reported that the use of natural products can reduce the bacterial load and, consequently, the development of halitosis. The aim of this study was to evaluate the antimicrobial activity of the essential oil of Melaleuca alternifolia on the growth and volatile sulphur compound (VSC) production of oral bacteria compared with chlorhexidine. Material and Methods The effects of these substances were evaluated by the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) and Minimum Bactericidal Concentration (MBC) in planktonic cultures of Porphyromonas gingivalis and Porphyromonas endodontalis. In addition, gas chromatography analyses were performed to measure the concentration of VSCs from bacterial cultures and to characterize M. alternifolia oil components. Results The MIC and MBC values were as follows: M. alternifolia - P. gingivalis (MIC and MBC=0.007%), P. endodontalis (MIC and MBC=0.007%=0.5%); chlorhexidine - P. gingivalis and P. endodontalis (MIC and MBC=1.5 mg/mL). M. alternifolia significantly reduced the growth and production of hydrogen sulfide (H2S) by P. gingivalis (p<0.05, ANOVA-Dunnet) and the H2S and methyl mercaptan (CH3SH) levels of P. endodontalis (p<0.05, ANOVA-Dunnet). Chlorhexidine reduced the growth of both microorganisms without altering the production of VSC in P. endodontalis. For P. gingivalis, the production of H2S and CH3SH decreased (p<0.05, ANOVA-Dunnet). Conclusion M. alternifolia can reduce bacterial growth and VSCs production and could be used as an alternative to chlorhexidine.

Efeito da severidade da doença periodontal sobre a expressão do Receptor Ativado por Protease do Tipo 2 (PAR-2) / Effect of the severity of periodontal disease on the expression of Protease Activated Receptor Type 2 (PAR-2)

Pesquisas recentes investigando o receptor ativado por protease do tipo 2 (PAR-2) sugerem uma associação entre este receptor e a inflamação periodontal. Além disso, é sabido que a gingipaína, protease bacteriana secretada por um importante periodontopatógeno, Porphyromonas gingivalis (Pg), tem a capacidade de ativar o PAR-2. Ademais, um estudo anterior do grupo, verificou que quanto mais profunda a bolsa periodontal, maior era a expressão do receptor PAR-2. No entanto, não é sabido se a expressão de PAR-2 é proporcional a severidade de doença periodontal e a quantidade de gingipaína expressa na bolsa periodontal. Desta forma, o presente estudo, verificou no fluido gengival a correlação entre a expressão gênica de PAR-2 (Real Time-PCR) com os parâmetros clínicos periodontais, e a expressão gênica da protease gingipaína em pacientes com periodontite crônica severa e moderada, antes e após o tratamento periodontal não-cirúrgico. A expressão de PAR-2 e da protease gingipaína foi estatisticamente maior nos pacientes do grupo periodontite crônica severa (PS) em comparação com os pacientes do grupo periodontite crônica modera (PM) e controle (C). Além disso, o tratamento periodontal levou à redução significativa (p<0.05) da expressão de PAR-2 nos pacientes com periodontite crônica moderada. Em conclusão, dentro dos limites do presente estudo, nós demonstramos que a severidade da doença periodontal e a expressão de gingipaína influenciaram a expressão de PAR-2 no fluido gengival de pacientes com periodontite crônica.

Recent studies investigating the protease-activated receptor type 2 (PAR-2) suggest an association between the receptor and periodontal inflammation. In addition, it is known that gingipain, a bacterial protease secreted by an important periodontopathogen, Porphyromonas gingivalis (Pg), has the ability to activate PAR- 2. Furthermore, a previous study from our group found that the deeper the periodontal pocket, the higher the expression of the PAR-2 receptor. However, it is not known whether the expression of PAR-2 is associated to the severity of periodontal disease and the amount of gingipain expressed in the periodontal pocket. Thus, the present study verified, in the gingival fluid, the correlation between the PAR-2 gene expression (Real Time-PCR) with the clinical periodontal parameters, and the gene expression of the gingipain protease in patients with moderate and severe chronic periodontitis before and after non-surgical periodontal treatment. PAR-2 expression and gingipain protease were statistically more expressed in patients of the severe chronic periodontitis group (PS) compared with those in the moderate chronic periodontitis group (PM) and control group (C). Furthermore, periodontal treatment led to a significant reduction (p <0.05) in the expression of PAR-2 in patients with moderate chronic periodontitis. In conclusion, within the limits of the present study, we demonstrated that the severity of periodontal disease and the expression of gingipain influenced the PAR-2 expression in the gingival fluid of patients with chronic periodontitis.

Microbial colonization in orthodontic mini-implants

Peri-implant inflammation contributes for loss of secondary stability of orthodontic mini-implants. The investigation of microbial colonization in this area would benefit its control, and consequently favor the long-term success of mini-implants. Therefore, the aim of this study was to determine the establishment and the evolution of microbial colonization process in orthodontic mini-implants for 3 months, since the time of their installation. One-hundred and fifty samples collected from 15 mini-implants were investigated from baseline up to 3 months. The biological material was obtained from peri-implant area using paper points. Nonspecific, Streptococcus spp, Lactobacillus casei and Candida spp colonizations were analyzed by cell growth methods. Porphyromonas gingivalis colonization was observed by 16S rDNA-directed polymerase chain reaction. Data from cell growth were submitted to the Wilcoxon sign rank test and results from molecular analysis were presented in a descriptive way. There was no significant difference in the microbial colonization among the examined time intervals, except for Streptococcus spp, between baseline and 24 h, which characterized the initial colonization in this time interval. Lactobacillus casei and Candida spp colonizations were insignificant. No Porphyromonas gingivalis was detected among the analyzed samples. The microbial colonization of mini-implants did not significantly change during the study. However, it should be monitored by orthodontists, since it is an important factor for mini-implants success.

A inflamação peri-implantar contribui para a perda da estabilidade secundária dos mini-implantes ortodônticos. A investigação da colonização microbiana desta área beneficiaria o seu controle e, consequentemente, favoreceria o sucesso dos mini-implantes a longo prazo. Portanto, o objetivo dos autores foi determinar o estabelecimento e evolução do processo de colonização microbiana em mini-implantes ortodônticos por três meses desde a instalação. Cento e cinquenta amostras coletadas de 15 mini-implantes foram investigadas desde o tempo inicial até 3 meses. O material biológico foi obtido da área peri-implantar com auxílio de cones de papel absorvente. As colonizações inespecíficas de Streptococcus spp, Lactobacillus casei e Candida spp foram analisadas por métodos de crescimento celular. A colonização por Porphyromonas gingivalis foi observada por meio da reação em cadeia da polimerase 16S rDNA. Os dados do crescimento celular foram submetidos ao teste de Wilcoxon sign rank e os resultados da biologia molecular foram apresentados de modo descritivo. Não houve diferença estatisticamente significante da colonização microbiana entre os intervalos de tempo avaliados, exceto para Streptococcus spp entre os tempos inicial e 24 h, o que caracterizou o início da colonização neste intervalo de tempo. As colonizações por Lactobacillus casei e Candida spp foram insignificantes. Não foi detectada a presença de Porphyromonas gingivalis nas amostras analisadas. A colonização microbiana nos mini-implantes não se alterou significativamente durante o estudo. No entanto, deve ser monitorada por ortodontistas, uma vez que é um fator importante para o sucesso dos mini-implantes.

Nociones actuales sobre la flora microbiana del surco gingival / Current notions on the microbial flora of the gingival sulcus

La enfermedad periodontal es un problema de salud bucal a escala mundial. Con el transcurso del tiempo, el conocimiento de la gingivitis ha sufrido grandes cambios, y es hoy en día una de las enfermedades de mayor frecuencia entre los pacientes que asisten a los servicios estomatológicos. Se realiza este estudio con el objetivo de profundizar en la relación entre los microorganismos de la placa dental y la etiología de la periodontitis. La placa dental es una comunidad microbiana compleja; como consecuencia de las interacciones entre las especies, se produce un nicho ecológico que favorece el crecimiento y la supervivencia de especies proteolíticas anaerobias estrictas, así como condiciones apropiadas para el desarrollo de periodontitis(AU)

Periodontal disease is an oral health problem worldwide. In the course of time, knowledge about gingivitis has greatly changed, and today, this is one of the most frequent diseases affecting the patients going to the dentistry service. This study was aimed at delving into the relationship between the dental plaque microorganisms and the periodontitis etiology. The dental plaque constitutes a complex microbial community; the interactions among the host species give rise to an ecological niche that favors growth and survival of strictly anaerobic proteolytic species as well as to adequate conditions for the onset of periodontitis(AU)